在细胞培养过程中，合理的培养条件和传代方法是确保细胞健康生长的关键。以下是关于细胞培养的详细步骤及注意事项。

培养条件

细胞培养的气相条件为95%的空气与5%的二氧化碳；温度控制在37℃，培养基采用MEM配方，添加10%的胎牛血清(FBS)和1%的青霉素-链霉素(P/S)。

传代方法

首次传代时，建议按照1:2的比例进行细胞分瓶。如果细胞的汇合度未超过80%，需将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5毫升完全培养基，放入37℃、5% CO2的孵箱中培养。

培养液的更换

建议每两天更换一次培养液，以保持细胞的良好生长状态。同时，建议在购买细胞时一并购买相关试剂，以获取更多优惠。

细胞处理与观察

收到细胞后，使用75%酒精对细胞瓶外壁进行消毒，并在超净工作台内进行无菌操作。将细胞瓶静置于37℃、5% CO2培养箱中3-4小时，以便细胞稳定后再进行处理。显微镜观察细胞生长情况，并拍照留存，重点记录前三天的变化，以便于后续售后支持。

细胞传代步骤

对于贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加0.25%的胰蛋白酶消化液约1-2毫升，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞形态变化，若细胞大部分变圆并脱落，迅速取出，轻敲培养瓶后加入5毫升以上完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，转移至15毫升离心管中，以1000 rpm离心5分钟，弃去上清液，补加1-2毫升完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（例如两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8毫升每瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

细胞冻存与复苏

尊龙凯时推荐的方法如下：

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。

2. 添加0.25%的胰蛋白酶消化液约1毫升，观察细胞回缩变圆的情况，然后终止消化，进行离心并加入无血清冻存液。

3. 冻存细胞直接放入-80℃冰箱中保存，若后续需要转移至液氮罐，应在-80℃保存24小时以上。

注意事项

在运输过程中，可能会发生一些细胞脱落，这是正常现象。如果脱落较多，可以收集培养液进行过渡培养，继续保持细胞状态。使用尊龙凯时的优质产品能更好地支持细胞的健康生长与恢复。

确保在细胞传代和冻存过程中遵循操作规范，定期更换培养液，细致观察细胞状态，将大大提升细胞实验的成功率。